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                        當前位置 > 首頁 > 技術文章 > 生物芯片(DNA微陣列)熒光掃描儀中的激光共聚焦掃描技術
                        生物芯片(DNA微陣列)熒光掃描儀中的激光共聚焦掃描技術
                        點擊次數:5719 發布日期:2008-5-2  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
                          所有的微陣列上的熒光須經熒光掃描裝置來分析其上的熒光強度和分布,在這些裝置中,激光共聚焦掃描儀具有優越的性能,能獲取高質量的圖像和數據,本文將分別介紹微陣列的相關特性和各種類型的微陣列掃描儀,激光共聚焦掃描儀的設計和關鍵特性,另外還將介紹一種已商品化的激光共聚焦熒光掃描裝置。

                          微陣列是由分子整齊排列于固相表面,這些分子與熒光分子結合,測定熒光分子的強度后可推知結合分子的濃度。固相部分主要有經過表面化學處理的玻璃片如22mmχ75mm的載玻片。在微陣列上包被的分子常常能與多種熒光探針通過化學鍵相互作用而聯結,通常情況下能聯結兩種熒光分子,例如在檢測不同樣品的基因表達的區別時,可將其中一樣品(如正常組織)標記上發綠光的熒光分子,將另一種樣品如腫瘤組織或發病組織標記上另一種發紅光的熒光分子,用兩種波長的激光激發微陣列上的樣品,通過比較兩種熒光在微陣列上某點的比例得知某類基因在兩種組織中的差異。

                          微陣列上有樣品組成的點陣,除了點之外,余下的是背景。如果玻璃片未經過表面化學處理,樣品在玻片上結合不牢固,且容易擴散,造成背景高。若玻璃片經過表面化學處理后,點樣的樣品在微陣列上結合牢固,點的直徑小,不擴散,從而點的密度增加,在進行熒光數據分析時,儀器將點上的熒光強度與點周圍的背景強度相比較,如果背景中含有與熒光波段相一致的物質,則背景強度增高,樣品的熒光信號將減弱,干擾信號的讀取。

                          點陣上的點直徑范圍為25mm-500mm,通常目前能達到的直徑為100mm±50,科學家們正在努力減小直徑。因為點直徑的變化對掃描結果的讀取產生影響,如果點的直徑大,熒光分子擴散的范圍也大,則觀察到的熒光強度相對較弱。

                          若在玻片上有灰塵或其它雜質如衣物纖維、皮屑、指紋等,掃描結果將受到影響。微陣列上的點干燥后形成很薄的層,使得激光共聚焦掃描成為可能,精心地調整掃描儀的焦距,可避免檢測出不需要的背景雜質,包括微陣列上的灰塵、玻璃中自帶的熒光雜質產生的干擾信號均可通過激光共聚焦的方式將其減少到最低程度。因為雜交因素影響,在微陣列上點與點之間的熒光強度差別很大。對微陣列掃描儀的要求要能夠有較寬范圍的靈敏度,通常來說,靈敏度調整范圍為10000:1。

                          當熒光化合物或染料受到激光激發后將釋放出熒光,在某一波長下有一最高釋放強度。各種熒光化合物有各自特定的激發吸收值。如圖1是FITC的波長對熒光激發強度曲線。從曲線圖可見,在494納米波長下,有一激發高峰,在518納米下有一釋放高峰,釋放與激發高峰波長相差24納米,這一現象在微陣列使用的染料中較普遍。兩高峰波長的差值在專業上稱之為Strokes shift, 初看曲線圖人們可能會以為:FITC在510納米的波長激發下,在475-510納米范圍內將釋放部分熒光,其實并不盡然;釋放波長一般情況下大于激發波長,在圖中的激發曲線不是與釋放曲線同時繪制的,將它們放在同一坐標圖中是為了便于觀看,其實它們是兩套不同的數據。激發曲線的繪制過程如下:在單一長波長下,變換激發波長在不同波長下測定熒光釋放強度,釋放熒光曲線的繪制過程則是在最長激發波長下開始增加波長,測定在不同波長下的熒光釋放強度。微陣列掃描儀設計者通過閱讀和分析某中熒光染料的激發曲線和釋放曲線來確定適合某種染料的復合掃描激發波長,該波長的激發效率至少要達到50-70%的水平。激發波長要避免太接近釋放高峰對應的波長,否則熒光信號受到干擾。所以應在峰值的左邊選擇一激發波長。如對FITC來說,建議的激發波長在470-495nm.熒光釋放強度在某一范圍內,與激發光的強度成正比,當熒光釋放達到最高峰后,增加激發光強度卻不能提高釋放強度,因為熒光釋放已經達到飽和或光子將染料破壞淬滅。微陣列上各點的熒光分子受到激發后,從各個方向釋放熒光光子,散射成球狀,所以掃描儀須將這些散射的光子采集到,由于掃描儀的使用的是很低的釋放光,幾何球狀是設計掃描設備的主要根據。


                          微陣列掃描儀可有多種設計類型,但任何類型的微陣列掃描儀都有以下基本功能:

                          激發光

                          激發光的產生源有多種,如激光、氬燈、LEDs或鎢絲燈。激發光的波長要避免將釋放光的波長覆蓋或重疊。對于LEDs或鎢絲燈需用濾光器來選擇某種特定波長的光。激光的波長單一不需要濾光器來選擇某種特定波長的光。燈泡光源可產生多個波長的激發光,通過多個濾光器可選擇多種特定的波長以滿足激發不同熒光的需要。激發光應直接射向微陣列上的待測樣品,通過大量一次照明的方式,待測樣品的大部分區域同時受到激發,這種方式在CCD數碼相機中較常見,該方式的缺陷是待測樣品的受到得激發光不夠均勻一致。這點是儀器設計者須考慮到的重要因數之一。另一種方式是:激發光聚焦于樣品的很小部分,采用特定的光線采集和定位,聚焦點上的激發光光線密度較高,大約為10000watt/cm2。激發波長的選擇是依據染料的激發曲線和釋放曲線的峰值來確定的,在染料激發峰值的左邊且激發效率較高的范圍內,在某種染料水平下,激發效率越低,要達到某種光強,則需要向樣品上發射的光越多。過多的發射光將通過光漂白作用破壞樣品和污染干擾釋放光的信號。

                          釋放光采集

                          熒光由目鏡的鏡頭來采集,該鏡頭聚焦于樣品上并將一定區域內的光線收集到裝置。收集的角度區域的大小非常關鍵,熒光釋放是球形的,目鏡對熒光的采集范圍是決定儀器的采集效率關鍵指標之一。目鏡采集光的角度由數值孔徑來表示,圖2表示了數值孔徑與光采集效率之間的變化關系。當數值孔徑為1.0時,目鏡將收集到整個半球的光,相應的光采集效率為50%。在許多激光共聚焦微陣列掃描儀的數值孔徑在 0.5-0.9, 而CCD-掃描儀的數值孔徑為0.2-0.5。有其他類型的掃描儀不用目鏡而是使用積分球面鏡來采集釋放的部分光源,但是部分光線經過多次球面反射而衰減。還有一些無散光收集裝置,僅僅是將探測器放在樣品的某一區域的上方,光線采集的效率受限于樣品被照明處的范圍及探測器的視角,例如,一個直徑為25mm的探測器放在激發點上方100mm處,其實際的有效數值孔徑為0.12。圖2顯示目鏡的不同數值孔徑與光采集效率的關系。

                        空間定位
                          是指對樣品上的某一小區域上的熒光信號進行熒光強度計算,微陣列上的各點樣品被分割為許多微小的像素,在進行熒光信號定量時,空間分辨率必須高于個點的大小,如微陣列上各點的直徑為100mm,則像素的大小為5-20mm?臻g定位可通過多元素探測器,如CCD或機械掃描裝置。許多相機設置為大范圍照明,探測器直接提供由許多像素組成的圖象,該方法的缺陷是CCD提供的目鏡數值口徑較小,后方照明及維持系統冷卻設備價值昂貴,由于光散射會導致像素之間交叉重疊造成信號不夠清晰。機械掃描過程包括以下幾個步驟:將激發光束聚焦于某一大小同像素差不多的點上,用單一元素的探測器采集那一小點上的釋放光。要將整個樣品掃描完全,則需移動樣品或用一微小的反光鏡使激光束移動掃描樣品。雖然掃描裝置增加了機械裝置的復雜程度,但比起CCD相機來,機械掃描可達到的數值孔徑更高,有更好的空間選擇性,探測器也較便宜些。在低強度的光源下,高光線采集率是至關重要的。

                          激發/釋放分辨

                          微陣列上各點的熒光釋放強度通常要比激發光強度弱幾個數量級,要從激發光中檢測出微弱的熒光信號,就需要對這兩種類型的光進行分離,由于光束中的光波長不相同,可利用光波分離將不同的光分開。許多裝有目鏡的掃描儀采用的是表面照明方式,激發光束與釋放光束從樣品到目鏡經過同樣的路徑只是方向相反。這種途徑使得從樣品上反射和散射的光與熒光束混合在一起,所以需要用光束分離器對混合光進行分離。一種類型的光束過濾器是色彩二向或多向過濾器。它將激發光束反射并把釋放光束以一較長的波長傳輸。這種濾光器對一、二或三種不同的激發/釋放光都可進行較好的分離,但若超過四種以上的混合光束則分離有困難。另外一種類型的光線分離器稱為幾何光線分離器,如圖3所示,在掃描系統中,目鏡的數值孔徑為0.6,像素的大小為10mm,從目鏡出來的激發光束比釋放光束細,一個小反光鏡將激光束反射但是讓環形部分的釋放光束通過,其分離效果與波長光束分離器相同。從理論上來說,光束分離器可以完全將激發和釋放光束分開,但實際上并非如此,通常在探測器前放濾光片過濾釋放光束。這些濾光片只允許染料的釋放高峰附近很窄的一段波長的光通過,而其他波長的光包括激發光都被阻擋了。這是微陣列掃描儀必需的的第二道光束分離裝置。有的掃描儀不用光束分離器而是將激發光束和釋放光束放在不同的軸上。該方法能將釋放光路徑的激發光發射回去,但卻難以達到較高的數值孔徑,因為目鏡離樣品很近,通常小于1毫米,所以激發光束能進入目鏡的角度范圍很小。其他具有區分不同波長光束的裝置有棱鏡、光柵等,這些裝置還可產生一些特殊的作用如連續的光波調諧功能。然而,在微陣列中,由于要求對激發光有高度的敏感性,因而對釋放光裝置也相應要求有很高的精密度。


                          檢測熒光掃描儀的探測器

                          將微弱的熒光信號轉化為電信號,在微陣列掃描儀中的光線探測器有:光電倍增管、CCD點陣探測器、雪崩光電二極管。各種裝置有其優點也有其缺點。不同檢測范圍的儀器要根據它們各自的特點來選擇合適的探測裝置。光電倍增管在可見光波范圍內是最靈敏的探測器,它屬于單點探測器并要求掃描系統對微陣列上的樣品進行空間定位,通過改變電壓可以很方便地改變光電倍增管的靈敏度。光電倍增管的靈敏度在紅外及近紅外波長范圍內降低得很快,所以它們的用途主要限制在可見光波長范圍內。CCD對微弱信號的放大功能不及光電倍增管,因而需要額外的放大系統來將信號放大才能達到光電倍增管的靈敏度范圍的上限。其主要的缺點是:CCD探測器的實際數值孔徑難以達到06-09的范圍,在低亮度背景下,限制微弱信號被檢測出來, 另外CCD探測器不能與共聚焦系統相兼容;但是在高亮度背景下, 因為CCD探測器有內置式掃描功能,其優越性就體現出來了。

                          所有的微陣列掃描儀都有固定和放置微陣列固相基質的裝置,我們稱之為掃描儀的載樣盒。載樣盒要有能夠容納下玻片的空間,組成其的材料應能經受的住上千次取放樣品的刮擦考驗。通常微陣列的固體介質為顯微載玻片,還有塑料片,但是塑料片不如玻璃片剛硬,容易變形,不易聚焦準確,所以多數研究者使用的是顯微載玻片。掃描檢測時通常是在室溫下進行,此時玻片上各點樣品已經干燥,然而,有些染料如FITC在潮濕的環境下才能釋放出強烈的熒光,所以研究者們在待測樣品上滴加適量的緩沖液,然后蓋上蓋玻片進行觀察。這就需要載樣盒能夠容納載玻片與蓋玻片疊加之后的厚度,掃描儀在掃描時聚焦于蓋玻片下的那一層平面進行掃描。

                          以下要介紹共聚焦掃描微陣列的工作原理,顧名思義,共聚焦掃描儀將視野中的兩個聚焦點的影象裝配為二維圖象,工作過程如所示:平行的激光束通過光束分離器后進入目鏡,目鏡采集到部分球狀散射的熒光釋放光并使這些光成為平行的光束,此外還采集被反射的激光,這些激光的強度要比熒光強度大3-7倍。采集回來的光束再次通過光束分離器,光束分離器將大部分激光反射回激光源處,并允許大部分熒光束通過光束分離器,一面平面鏡將熒光束反射到釋放光柵處,光柵選擇很窄范圍波長的光通過,并將剩余的激光激發光全部反射回去。共聚焦的工作特點體現在探測目鏡和開了一個針孔大的孔的光線擋板上,探測目鏡將平行光聚集為很小直徑的一束光之后,擋板上的小孔只允許聚焦的光線通過并將其余的光遮擋住。圖5顯示若發光點不在目鏡焦點范圍內,則光線將被探測目鏡聚集于擋光板前,散射之后大部分光線被遮擋了,只有焦點范圍內的光線才能有效地進入當光板的小孔被探測器檢測到。對焦距范圍的嚴格限制使得灰塵或近表面的小顆粒均不能成像被探測到,因而共聚焦掃描儀獲得圖象的信噪比要高于非共聚焦掃描裝置。但另一方面,對焦距范圍的嚴格限制要求載玻片擺放非常平穩,掃描運動過程中載樣盒要保持在同一水平面上,偏差要小于焦距的范圍,偏差小于±10mm。這一要求增加了機械加工的精密度,使得加工工藝更加復雜,但這是保證獲得最佳圖象質量的有效途徑之一。

                        由于激光共聚焦于載玻片上的一點上,要獲得整張玻片上的各點的熒光信息則要對玻片各點進行掃描成像?赏ㄟ^移動掃描器或移動目鏡和載玻片來實現上述功能。掃描器移動后要求目鏡能采集到熒光釋放光束,這樣的目鏡很復雜且數值孔徑不超過0.3,較為簡單的并且采集光效率高的辦法是移動目鏡或載玻片,但移動的物體大勢必影響掃描速度。不過在弱光環境下,圖象讀取速度取決于探測到的光子的累積量,所以即使掃描速度快而光采集效率低的話圖象讀取信號也未必快。
                          所有的掃描儀都會面臨同樣的一個問題,即如何將背景降低并提高待測樣品的信號。共聚焦技術的應用使得共聚焦掃描儀能比其它類型的掃描儀獲得更高質量的圖像信號。在共聚焦掃描儀中有光束分離器及釋放光柵將熒光信號分離并傳輸給探測器,而將激發光和雜質產生的光反射回去并阻擋它們到達探測器。探測器是光電倍增管,其靈敏度高,可探測到一個光子的存在,光電倍增管內的功率放大器可將光信號轉化為電信號并放大100萬倍,通過調整電壓輸出可改變光電倍增管的靈敏度范圍,微陣列上不同樣品的制備過程導致對儀器靈敏度要求不同,內置式的可調靈敏度裝置恰好可適應這些不同的變換。傳統的硅探測器如PIN光電二極管,沒有內置放大裝置,在可見光范圍內靈敏度很低,因而需要外置的功率放大器,這就增加了雜訊,降低了信噪比。硅探測器在800-900nm范圍內有一波長應答高峰,因此用它們探測近紅外范圍的染料較為理想。光電倍增管通常在500nm左右范圍內有一波長應答高峰,高于650nm后則靈敏度迅速降低。它們適用于大部分可見光范圍的染料。

                          微陣列掃描儀靈敏度范圍要求:在微陣列樣品制備過程中,步驟較多,如PCR反應、雜交反應條件變化多、試劑存儲條件不同、不同類型的基因表達等因素的影響,即使適用相同的染料,其亮度也可能相差1000倍,在同一快微陣列上的熒光強度范圍可達到4000:1的范圍。大部分掃描儀的熒光強度讀取范圍在4000-16000,若不改變儀器的靈敏度范圍,就無法適應各種熒光強度樣品的讀取。調整儀器靈敏度范圍的方法有兩種:其一是改變激發光的強度,用激光衰減器可調整改變激發光的強度其可調范圍至少為100:1。其二是改變光電倍增管的靈敏度,通過變化輸入電壓的大小,光電倍增管的靈敏度改變范圍至少為100:1。兩項調整方式可相互疊加使得儀器的調整范圍增加到10000:1,這一范圍對普通的掃描儀都足夠了。通常人們希望使用的激光強度大而不破壞樣品上的熒光分子,我們已經知道,激光強度越大激發的熒光光子越多,信號也越清楚和強烈。但是若樣品經過多次掃描后,被破壞的熒光光子將增加,所以要將熒光強度降低以防樣品上的熒光淬滅。

                          信號轉換及采樣過程:由被激發的熒光染料產生的光學信號將通過一系列過程轉變為數碼信號。熒光信號是由一系列隨機的光子釋放累加而成。若將它們累計可與某一樣品區域的染料分子的密度相關。通常掃描儀對空間上和時間上探測到的熒光光子的數量都加以累計并取平均值才能代表某一樣品區域的染料分子的密度。被掃描的區域被分為大小相同的像素。激光共聚焦和其它點-照明式掃描儀對逐個像素進行激發,然后探測器累加各像素點上熒光釋放分子。將光信號轉化為電信號并數值化。各像素的數碼分辨率可達到16-比特,當掃描圖像正在進行時,顯示器要顯示圖像以供掃描者作初步的分析,掃描過程結束后可將圖像保存為圖像格式文件如TIFF格式,這種格式的圖像文件時目前用途較廣的一種圖像文件。

                          控制和自動化系統是由電腦來完成的。掃描儀使用者無須精通掃描儀的光學和電子學部分,已商品化的掃描儀已經經過大量的測試和信息反饋并不斷地改進,使其用戶界面越來越友好,圖形化的操作界面使得初學者只需接受簡單的訓練或閱讀操作手冊就能夠使用儀器?刂栖浖哂性S多自動設置功能,為使用者節省時間提高工作效率。如:不同的用戶掃描不同樣品可設置、保存、再現掃描參數;可自動設定2個以上的掃描激光波長并自動保存圖像結果;對某一掃描波段自動調整靈敏度、激發光強度、及探測器探測范圍等。

                          掃描儀各部件功能參數主要如下:

                          激光源的數目和熒光波段 第一代微陣列掃描儀通常是兩個或四個熒光波段及兩個激光光源,而第二代儀器則含三或四個激光光源并可選擇10種熒光波段。

                          另外,分辨率、靈敏度、掃描速度、掃描視野、掃描圖像定位的準確程度等指標也是設計和制造微陣列掃描儀所需考慮的技術指標。微陣列掃描儀之間的比較是一個復雜的過程,不應僅僅對單個性能參數進行比較,通常需要對掃描樣品進行綜合測試。

                          ScanArray共聚焦微陣列掃描儀

                          General Scanning ,Inc.公司已經建立了ScanArray共聚焦微陣列掃描儀的生產線,目前全世界的許多生物技術和遺傳基因組分析實驗室都在使用該種儀器進行科研工作。

                          ScanArray的結構組成是:樣品載體移動、光源固定、多個激光頭的共聚焦掃描儀。數值孔徑可達0.75,掃描速度達20線/秒。

                          ScanArray共聚焦微陣列掃描儀優越性能表現在:操作簡單、體積小,數值孔徑高、掃描速度快,靈敏度和分辨率高。

                         目前有兩種型號:ScanArraya3000和ScanArraya5000

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